糖被與莢膜

細菌的糖被(Glycocalyx)與莢膜(Capsule)

前言 Introduction

許多細菌的表面都具有多醣體的存在，而將這些多醣體命名為glycocalyx，其主要的功能可幫助細菌在惡劣的環境下生存，抵抗宿主免疫系統的攻擊，而glycocalyx在細菌表面的結構緊實或鬆散與否可構成capsule或slime layer，然而在細菌表面我們多發現capsule為細菌防禦的第一線，關於glycocalyx與capsule的詳細介紹將在以下作詳細的說明。

糖被｜Glycocalyx

所有的細菌表面多少都含有一些glycocalyx.

• 組成

glycocalyx主要由polysaccharide, polypeptide, 或兩者混合所組成的一層viscous (sticky) polymer，分布在細胞壁外面，譬如 cellulose (Acetobacter xylinum)、dextran and levan (certain Streptococci)。glycocalyx是怎麼來的呢？細胞核內的DNA會經過轉錄、轉譯等一連串步驟製造出一些peptides等一些小分子，並將它們分泌至細胞外的基質，慢慢地，這些小分子就會聚集成glycocalyx，圍繞在細胞四周。在glycocalyx，不同的polysaccharides加上不同的polyalcohols或amino sugars這些成分，造就了細菌的species specific，這個特性可應用在臨床上對於檢體內未知菌種的初步鑑定。glycocalyx的產生是視外界環境而定的。

• 位置:outside the cell.

• Glycocalyx可依其結構鬆散分成兩種

1. capsule：結構較緊密扎實(tightly)
2. slime layer或EPS(extracellular polysaccharide)：結構較鬆散(loosely), more diffuse, 容易被水沖掉。

這兩種可用negative staining(India ink)來區別.

• 功能

1. 在水分不足時，可保持細胞濕潤，即保持水份的散失。
2. 可以抵抗宿主的免疫吞噬 (phagocytosis)，造成對宿主的致病力。例如：Streptococcus pneumoniae、Bacillus anthracis。
3. 幫助菌體附著在物體表面，例如牙齒表面或是石頭表面 (Biofilm)；biofilm的形成會受到外界環境營養、溫度、溼度等因子所影響。

另一個例子是Vibrio cholerae，它是引起cholera的病原菌，其glycocalyx會幫助它附著在宿主的intestinal villi。

1. Glycocalyx可以藉著跟一些離子及分子結合而由外界抓住需要的養分 (nutrient trap)並提供菌體利用，
2. 抓住菌體代謝的廢物，防止它們又跑回菌體干擾細菌的正常代謝。
3. 避免病毒及一些毒素的侵害，譬如detergents。

莢膜的結構｜Capsule的結構

Capsule是由細胞往細胞壁外圍所分泌的物質所構成的是由所謂的glycocalyx緊密且堅固的附著在細胞壁外面，而使細菌與四周有明顯的界線。Capsule的主要功能為黏著性,由於其粘著性的可使細菌附著在不同的物質上。除此之外，最被大家所知的部分為，capsule可以增加細菌的致病力，其主要是能保護細菌免受到宿主的細菌的吞噬，其中Streptococus為最常見的例子。除了具有致病力外，莢膜亦可以擺脫宿主的免疫系統攻擊，因莢膜具有逃避補體活化和條理作用的功能。

Capsule主要的組成是以polysaccharide為主體，其外圍具有大量的salic acid。且依菌種不同會有許多組成結構上的差異，所以就以group B Streptococcus(GBS)為例。 Group B Streptococcus (GBS)的capsular polysaccharide可以分成四種主要形式，Ia，Ib，II， III四類。而最近又發現有其他了兩類subtype，分別為IV及V的polysaccharide。其capsular polysaccharide會藉由phosphodiester bound而與cell wall peptidoglycan 鍵結在一起。

而capsular polysaccharide再不同的bacteria中會有結構上的差異，如Group B Streptococcus(GBS)的不同subtype。顯而易見的，其基本的架構是十分相似，主鏈上的主要結構以 [→4)β-Glcp-(1→4)- β-D-Galp(1→]n 為主體，但因其分支上碳上的鍵結不同而有不同的差異。以type Ia及type Ib為例，其在分支上只因為在不同的碳上鍵結，導致capsule在結構上產生差異。因此，capsule的主要組成為polysaccharide，而依其醣類上碳的鍵結不同，造成capsule在不同的strain而會有不同。

Capsule之功能

Capsule於bacteria之功能在於:

• 保護bacteria抵抗環境乾燥 (protect against drying)
• 阻止bacteria內養分的流失 (trap nutrients)
• 抵抗bacteria被吞噬 (resist phagocytic engulfment)
• 使bacteria能附著於環境中物品的表面 (adhere to environmental surfaces)
• 幫助bacteria到別處繁殖 (Colonize)
• 當bacteria處在充滿水的環境，抵抗水的進入 (resist flushing)

細菌的capsule對於保護細菌抵抗宿主免疫系統的攻擊是很重要的，polysaccharide capsule可以抑制Gram-positive and Gram-negative細菌被吞噬，在了解capsule如何逃避宿主的免疫機制中的吞噬作用之前，我們應先來了解吞噬作用是如何進行的，而吞噬作用的啟動需要一個重要的步驟--辨識，常見的吞噬作用中的辨識有兩種方式:

• 單純的吞噬作用: 此吞噬作用不經由抗體作用，單純的經由bacteria表面的epitope與吞噬細胞辨識而被吞噬。

吞噬細胞藉由細胞表面的辨識機制 ( endocytic pattern-recognition receptors ) 來辨識細菌表面的epitopes ( pathogen-associated molecular patterns ) 達到進行吞噬作用的第一個步驟。

• 複雜的吞噬作用: 此吞噬作用主要依靠抗體與補體的幫助來吞噬bacteria

抗體 ( IgG ) 與補體 ( C3b ) 會先與細菌表面的epitopes辨識而binding上，再與吞噬細胞表面的抗體補體接受器 ( receptor for IgG and C3b ) 結合而啟動吞噬細胞的吞噬機轉。

當細菌被吞噬細胞辨識之後，接下來將要啟動下個步驟將細菌吞到吞噬細胞體內，再經由酵素作用將細菌消化分解: 。

• 辨識之後吞噬細胞體內actin filaments會進行聚合與去聚合的作用，使吞噬細胞能伸出偽足將細菌包圍。
• 包圍細菌後形成phagosome，吞噬細胞內的lysosome會與phagosome融合。
• lysosome內的酵素將細菌分解掉。

細菌的capsule是一個主要具補體抗性以及毒力因子的致病因素，不具capsule之細菌再進行吞噬作用時只會被捕體調理 ( opsonized ) ，然而具有capsule之細菌則受到專一性抗體與補體作用。但是capsule能阻止補體的辨識功能，利用將補體埋在capsule與cell wall之間來達到逃避吞噬作用，此外，不同組成的capsule對於抑制補體的作用也不同，例如: 具有第三類capsular polysaccharides的group B streptococci，其capsule有sialic acid成分在，此可藉由抑制替代路徑而抑制補體沉澱。詳細的機轉目前並不清楚，但推測有一種可能為被sialylated的結構和factor H結合(此為替代路徑中C3 convertase的fluid phase regulator)。Capsular sialic acid polymers的組織不同，也許會導致與factor H相結合的糖類分子在量上的不同。

Capsule除了抵抗宿主的免疫機制之外，也會附著在環境中物體的表面，如:樹根、牙齒、石頭等處，還有colonize以及resist flushing。例如:許多的正常菌群可以製造a capsular polysaccharide matrix或glycocalyx在宿主組織形成biofilm，在人體常見的是牙菌斑。

至於其他的capsule功能主要在於保護細菌不受外界環境改變而造成其損傷或死亡，使細菌能輕易的在乾燥、潮濕或缺乏營養的環境下，能維持一段生命，不會因一旦環境改變就死亡，一切都是為了能達到生存與繁衍後代的目的。

應用｜Application

疫苗｜vaccines

有capsule的細菌常引起嚴重的感染症(Encapsulated disease)，如菌血症、腦膜炎、肺炎等，尤其在小孩子感染會特別嚴重，capsule扮演細菌的致病因子(virulence factor)及引起免疫反應的部位，因為capsule結構具polysaccharide的特性，polysaccharide具抗原性，能引起免疫反應，當抗體和capsule結合會形成bacterial cell-to-phagocytic cell ligand或補體的activator，在吞噬作用時，達到opsonization使細胞死亡；可利用capsular polysaccharide來備製具有預防能力的疫苗。

capsular polysaccharide是在細胞表面上由寡糖重覆單位組成的聚合物，因為他們帶有負電、高度親水性並會和四級氨(quaternary ammonium)清潔劑結合，使得它們可以自不同的乙醇沈澱物分離出及從有機溶劑析出物離心純化出 此種疫苗和polysaccharide抗原引起的免疫反應(和抗原抗體的物理化學性質有關，如分子大小、特異決定位、結構等)、與T、B淋巴球細胞的作用、宿主抵抗機轉有關，目前已有或是正在努力研發的疫苗如下：

(A) Neisseria meningitides

依capsule分類有12種血清型，目前已有A及C型的疫苗，B型的capsual polysaccharide幾乎無法造成免疫反應(抗原性不佳)，目前正在考慮研發其conjugated 疫苗，但仍需避免B型polysaccharide與胎兒腦組織抗原cross-react的情形

(B) Streptococcus pneumoniae

亦有許多的血清型，會造成肺炎、腦炎等，有高度的死亡率，尤其在孩童、老人、免疫能力不佳的人尤甚，現在有利用conjugated vaccine方法來備製預防性疫苗

(C) Haemophilus influenzae Type b(HIb)

Haemophilus influenza有a,b,c,d,e,f血清型，但只有Type b會造成嚴重症狀：嚴重的細菌性腦膜炎，1985年，Hib vaccine(又稱PRP: polyribosyl- ribitol- phosphate)在美國已被認可使用在18至24個月的孩童及老人身上，有兩種疫苗在使用：Hib conjugate vaccin、Diphtheria-pertussis-tetanus (DTP) combined vaccine，它們使得Hib disease在美國發生率自60/10000降低至1/10000

(D) Salmonella typhi

Salmonella typhi是Samonella species唯一具有capsule的：Vi Antigen，會造成typhoid fever，疫苗有：Heat-inactivated phenol- preserved vaccine、Acetone-inactivated and dried vaccine、purified Vi polysaccharide vaccine、Ty21a(Oral vaccine)、killed whole-cell vaccine、purified Vi

(E) Klebsiella pneumoniae

常造成菌血症、肺炎、泌尿道感染，依K antigen可分成82種血清型，capsular polysaccharide亦為主要致病因子

因為在孩童對capsule有較弱的免疫反應，為了增強capsular polysaccharide vaccine的immunogenicity，可以利用polysaccharide-protein conjugate vaccine。

Vaccine的製備

Conjugate vaccines主要是從其中包含有整個repeating unit及side chain的sialic acid的capsular做純化作為antigen，加上tetanus-toxoid(TT)的處理，使得動物體內可以引起specific antibody。在GBS type Ⅳ的serotype中，使用strain 3139菌種，養在 2-L chemostat中，使用NMR來確定是否都為GBS type Ⅳ。首先 GBS type 的purified capsular polysaccharide (CPS)用sodium periodate氧化，接著使用sodium cyanoborohydride使GBS type Ⅳ CPS接上tetanus-toxoid。GBS typeⅦ 使用strain 7271製備的方法同上。GBS type 4的有46%(w/w)的碳水化合物，62%(w/w)的蛋白質。GBS type Ⅶ的conjugate vaccines有 44%(w/w) 碳水化合物，及47%(w/w)的蛋白質。

而在接種兔子實驗中，接種conjugate vaccines (GBS type Ⅳ CPS-TT)的兔子27隻中，有25隻可以在感染GBS type Ⅳ後存活，高達93%，而如果接種GBS type 4 CPS或是saline的25隻兔子中，則沒有一隻可以在感染GBS type Ⅳ後存活。在GBS typeⅦ 的conjugate vaccine(GBS type ⅦCPS TT)的18隻兔子中，18隻在感染GBS type Ⅶ後都存活，而如果接種GBS type Ⅶ CPS或是saline的兔子，則分別只有3%及0%的存活率。如此一來，使用conjugate-TT vaccines所能得到的specific antibody效果比單純CPS引起抗體來的有效。有效的增加存活率。

結論｜Conclusion

Glycocalyx及capsule同屬於多醣體，在細菌的生存扮演極重要的角色，可以逃避宿主的攻擊，藉此可以製成疫苗幫助人類在對抗疾病攻擊的重要防禦，但是並非只要使用一次疫苗即可達成終生免疫的目標，原因在於多醣體的變異性，細菌的capsule組成非常的多樣性，這是造成細菌可以不斷逃避免疫攻擊的主要因素，因此，疫苗的使用主要用意在於降低細菌引起疾病的程度。

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